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              常見鈣指標的Meta分析

              來源: 西安百螢生物科技有限公司   2019-2-22   訪問量:2439評論(0)

              鈣是參與真核生理學的最普遍的離子之一,參與從骨發育到信號轉導的重要過程,細胞內鈣調節的紊亂可導致嚴重的神經和結構并發癥。由于其重要性,鈣在細胞水平上研究是一個相對較大的主題。為了可視化和量化細胞內鈣,研究人員采用熒光鈣指示劑(或染料),可以螯合自由漂浮的鈣離子,以產生定量的熒光反應。當與熒光顯微鏡,酶標儀或流式細胞儀配對時,鈣指示劑可用于成像和監測細胞內鈣濃度。

              熒光鈣指示劑可以是基因或化學工程。遺傳指標涉及在活細胞或動物中轉染或表達GFP變體,而化學指示劑由基于BAPTA的小分子組成,其對鈣離子具有高選擇性。在這兩大類鈣指標中,化學指標主要受到青睞,因為它們的商業可用性,便利性和實驗設計的靈活性。

              目前選擇的化學指標中有相當受歡迎的單波長鈣指示劑,無論它們是否與鈣結合,它們只會發出一種顏色的熒光。傳統的綠色熒光鈣指標包括Fluo-3及其改良版Fluo-4。Fluo-4是由Gee及其同事在2000年開發的。它本身基本上是一種非熒光底物,但一旦與鈣結合,其熒光增加了100倍。其成像技術使研究人員能夠發現鈣信號傳導中的許多相互作用,最近,它已被廣泛應用于基于細胞的HTS分析中,用于藥物發現。Fluo-4是Fluo-3的類似物,其中兩個氯原子被氟原子取代,


              盡管Fluo-3進行了輕微的結構修改,但Fluo-4在產生更明亮和更敏感的信號方面取得了巨大進步,使Fluo-4成為共聚焦顯微鏡,流式細胞儀和微孔板篩選應用的理想選擇。Fluo-4的細胞滲透型Fluo-4 AM是一種流行的綠色熒光鈣指示劑,不需要對背景噪音進行淬滅。

              即使熒光增加了100倍,Fluo-4 AM在一些領域也不乏問題。遇到的一個常見問題是由于電池泄漏導致的低信號背景比。為了解決這個問題,Fluo系列的大多數指標將與一種試劑配對,該試劑可防止熒光反應離開細胞或溶解滲漏以減少背景信號。這些試劑的實例包括丙磺舒或磺胺吡喃酮抑制細胞膜中的陰離子轉運蛋白,以防止鈣的任何通過。常見的相容性表面活性劑是Pluronic®多元醇,有助于將染料溶解在水溶液中。然而,這些物質的應用使細胞環境受到更多侵入性操作,并且可能影響整體細胞完整性或鈣活性。為避免使用額外的試劑,可選擇Cal-520 AM。綠色染料Cal-520經過優化,可解決染料損失問題及其改善的細胞內保留,因此不需要額外的試劑來保持鈣含量或抑制背景。CAL-520 在與Fluo-3和Fluo-4類似的光譜下實現更高的靈敏度和信號背景比。

              除染料損失外,使用Fluo-4的另一個缺點是保持其使用所需的苛刻的細胞負載條件。另一種綠色染料Fluo-8可以在室溫下裝載細胞,而不是Fluo-3和Fluo-4所需的37攝氏度。由于Fluo-8的性能不依賴于溫度,因此它是HTS應用的理想選擇。Fluo-8也以不同的解離常數(更高更低)制備親和力)和包裝尺寸,包括HTS就緒尺寸。最后但同樣重要的是,Fluo-8發出的信號比Fluo-4強兩倍。與Cal-520一樣,Fluo-8與Fluo-4具有非常相似的激發和發射峰,同時是進行綠色熒光成像的更容易獲得的通用選擇。

              化學鈣指示劑的另一個麻煩的方面是它們在細胞內分隔的傾向。一種表現出這種現象的染料是Rhod-2 AM,一種流行的紅鈣指示劑。它的凈正電荷促使許多類型的細胞中的線粒體被隔離。Rhod-2在線粒體中的這種定位在其引入細胞后不久發生,導致活細胞內的熒光信號有限。Cal-590被設計為保留在細胞的胞質溶膠中,而不是其線粒體,液泡或其他細胞器,同時保留Rhod-2的光譜波長。Cal-590適用于紅色染料成像的全面細胞成像。還有右旋糖酐形式鈣指示劑可用于區室化和細胞內染料保留中更有效的測量。向染料分子中加入大分子葡聚糖允許高溶解度同時保持低毒性,這使其在與染料綴合時作為區室化或滲漏的預防是完美的。選擇使用葡聚糖時產生的唯一缺點是它必須通過貼片移液管或顯微注射注入細胞。

              除了增強的熒光和改善的細胞質保留外,Cal系列染料(Cal-520Cal-590Cal-630)具有用于多重檢測或多色檢測的光譜質量。Cal-520的激發最大值保持在492,比其他綠色染料的激發最大值更接近氬激光488 nm。這種接近488 nm的特性使Cal-520可與任何熒光儀器平臺兼容。激發最大值分別為573和608 nm,發射分別為588和626 nm,紅色Cal-590Cal-630的長波長使它們與綠色熒光蛋白(GFP)細胞系以及FITC兼容 和AlexaFluor 488標記的抗體。



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